免疫细胞新贵 - iNKT细胞,一次脐带血捐赠可供多达5,000剂治疗
一种工程化的HSC-INKT细胞（蓝色）正在攻击人类肿瘤细胞。
前言 /
免疫疗法是利用人体的免疫系统来对抗疾病，该疗法彻底改变了人们对于疾病的认知，也使得癌症的治疗不再骑虎难下。但通常免疫疗法-尤其是那些免疫细胞的疗法——必须针对个体患者量身定制，这不仅耗费了宝贵的时间，并且治疗成本高达数十万美元。
综上，一个突出的例子是嵌合抗原受体 (CAR) 工程化T (CAR-T) 细胞过继疗法，已被美国食品和药物管理局 (FDA) 批准用于治疗CD19+ B细胞恶性肿瘤。不过目前大多数 T 细胞疗法都属于自体细胞疗法，需要将患者身上收集的 T 细胞加以改造并用于治疗单个患者，部分患者因淋巴细胞严重减少而受限。因此，可以大规模生产并易于分发以治疗各种癌症患者的同种异体细胞产品的需求量很大。
这就提出了另一个问题：免疫细胞药物能否像药房里的药物那样，“现货成品”且立等可取？
发表在《Cell Reports Medicine》杂志上的一项研究中，加州大学洛杉矶分校的研究人员，将稀有但功能强大的免疫细胞开发成“现货”制剂，这些免疫细胞可能会大量生产、储存并且长期和安全地用于治疗各种癌症患者。
主导这项研究的加州大学洛杉矶分校再生医学和干细胞研究中心的成员 Lili Yang 说：“为了惠及最多的患者，我们需要能够大规模生产、冷冻并运送到世界各地医院的细胞制剂。Yang和她的同事专注于自然杀伤 T 细胞（iNKT 细胞）的研究，NKT (iNKT) 细胞是一小群αβ T淋巴细胞。
与传统T细胞相比：
iNKT细胞可以通过多种机制和更高的效率攻击肿瘤细胞；
可以更有效地进入和浸润实体瘤；
可以改变实体瘤免疫抑制微环境；
最重要的是，不会诱发GVHD。
(iNKT) 细胞是开发同种异体细胞疗法的理想细胞载体，然而健康的献血者血液中含有极少量的内源性 iNKT 细胞。洛杉矶加州大学的研究人员开发了一种使用造血干细胞产生大量这些 iNKT 细胞的新方法，通过结合造血干细胞 (HSC) 基因工程技术和体外分化，研究小组生成了人类同种异体HSC工程 iNKT ( Allo HSC-iNKT) 高产量、高纯度的细胞；这些细胞与内源性 iNKT 细胞非常相似，具有多种机制有效靶向肿瘤细胞，并表现出高安全性和低免疫原性。
图1：异基因HSC工程化iNKT（Allo HSC-iNKT）细胞的体外生成
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来源：参考资料[1]
高产量降低治疗成本
研究结果表明，一次脐带血捐赠可以产生多达 5,000剂的治疗，一次外周血捐赠可以产生多达300,000剂， 以这种产量，生产免疫细胞产品的成本可以大幅降低。
Allo HSC-iNKT 细胞的生产非常稳定；研究小组从所有测试的12个供体（4个CB-HSC 和 8个PBSC）中生成了高纯度和高产量的Allo HSC-iNKT 细胞产品（图1G 和 1H）。据估计，从一个CB供体（包括∼5 × 106 CB-HSCs）中，可以产生∼5 × 1011 Allo HSC-iNKT 细胞，这些细胞可能被制备成约 500-5,000 个剂量（ ∼108 -109 个细胞/剂量基于批准的 CAR-T 细胞治疗剂量）; 从一个PBSC 供体（包括 ~5×108 PBSCs），可以产生~3 × 1013 Allo HSC-iNKT 细胞，这些细胞可能被制备成 ~30,000–300,000 剂量（图1G）。所得的Allo HSC-iNKT 细胞产品没有 GVHD 风险，适合“现货”应用。
Lili Yang和她的合作者将Allo HSC-iNKT的抗癌能力与称为自然杀伤（NK）细胞抗癌能力进行比较。研究表明，在实验室培养皿中，HSC-iNKT 细胞在杀死多种类型的人类肿瘤细胞（包括白血病、黑色素瘤、肺癌、前列腺癌和多发性骨髓瘤细胞）方面明显优于 NK 细胞。
图2 ：Allo HSC-iNKT 细胞的表征和基因分析
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来源：参考资料[1]
如图所示，与PBMC-iNKT 甚至 PBMC-NK 细胞相比，Allo HSC-iNKT 细胞表达了极高水平的 NK 激活受体基因（例如NCAM1、NCR1、NCR2、KLR2和KLR3），但表达了低水平的 NK 抑制受体基因（例如，KIR3DL1、KIR3DL2、KIR2DL1和KIR2DL2），表明Allo HSC-iNKT 细胞可能表现出优异的抗肿瘤 NK 功能（图2G）。
HSC-iNKT 细胞表达了极高水平的多种组织炎症归巢标记基因（例如，CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6和CXCR3），与内源性先天T细胞（即 PBMC-iNKT 和 PBMC- γδT 细胞）相似，但显着高于内源性常规 αβ T 和 NK 细胞（即 PBMC-αβTc 和 PBMC-NK 细胞），表明Allo HSC-iNKT 细胞具有很强的靶向和穿透肿瘤部位的能力（图2H ）。
图 3 Allo HSC-iNKT 细胞通过内在 NK 功能的肿瘤靶向
细胞表面标志物的流式细胞术分析表明，Allo HSC-iNKT 细胞表达了显着更高水平的 NK 激活受体（即 NKG2D 和 DNAM-1），而几乎检测不到 NK 抑制性受体（即杀伤细胞免疫球蛋白样受体，KIR）（图 3A和 3B)。NK 激活受体识别应激分子（例如，MIC-A/B 和 UL16 结合蛋白 1-4、ULBP1-4，被 NKG2D 识别，CD112 和 CD155 被 DNAM-1 识别）在许多肿瘤细胞上上调并触发肿瘤靶向，而NK 抑制性受体识别匹配的“自身”主要组织相容性复合体 (MHC) 分子并抑制肿瘤杀伤。细胞内效应分子的流式细胞术分析表明，与 PBMC-NK 细胞相比，Allo HSC-iNKT 细胞产生了极高水平的细胞毒性分子（即穿孔素和颗粒酶 B）（图 3A和 3B）。总的来说，这些结果证实了Allo HSC-iNKT 细胞通过其固有的 NK 功能具有良好的抗肿瘤潜力。
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来源：参考资料[1]
更重要的是，HSC-iNKT 细胞在冷冻和解冻后仍能保持其杀伤肿瘤的功效，这是现货细胞疗法规模化普及的基本要求。
CAR-Allo HSC-iNKT 细胞
研究人员向 HSC-iNKT 细胞添加了一种靶向多发性骨髓瘤细胞上的蛋白质CAR，然后测试了细胞对抗移植到小鼠体内的人类多发性骨髓瘤肿瘤的能力。
这些配备 CAR 的 HSC-iNKT 细胞消除了多发性骨髓瘤肿瘤，接受这种治疗的小鼠一生都没有出现移植物抗宿主病等并发症的迹象。这些研究结果支持了Allo HSC-iNKT 细胞，作为 CAR 导向的癌症免疫治疗的现货成品具有极大的潜力。CAR 工程化的Allo HSC-iNKT 细胞的高抗肿瘤功效和多种肿瘤靶向机制，可能为难以治疗的肿瘤和免疫逃逸，提供了新的机会。
图4 Allo HSC-iNKT 细胞通过嵌合抗原受体 (CARs) 改造后的肿瘤靶向杀伤能力
相对于异体HSC-iNKT细胞，异基因BCAR-iNKT细胞表现出更强的肿瘤细胞杀伤（图4 E）。在高肿瘤负荷条件下，AlloBCAR-iNKT 细胞仍然能够有效地抑制肿瘤生长，并在一小部分实验小鼠（五分之二的小鼠）中实现了肿瘤清除；传统的 BCAR-T 细胞抑制肿瘤生长的效果较差，无法实现肿瘤清除（图 4 K-4N 和S2 E）。
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来源：参考资料[1].
Allo HSC-iNKT 细胞的安全性
移植物抗宿主 (GVHD) 反应是同种异体细胞疗法的主要考量的安全问题。由于iNKT 细胞不会对错配的HLA分子和同种异体抗原产生反应，因此预计这些细胞不会产生排斥反应。为了验证Allo HSC-iNKT 细胞的这一安全特性，研究小组进行了体外和体内研究。在体外混合淋巴细胞反应 (MLR) 分析中，与传统的 PBMC-Tc 细胞形成鲜明对比的是，Allo HSC-iNKT 细胞对所有测试的错配健康供体 PBMC 均不产生反应，这证明它们不产生 IFN-γ。（图 5A和 5B)。
图5 Allo HSC-iNKT细胞安全性研究
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来源：参考资料[1].
在体内NSG小鼠异种移植模型中，与诱导GVHD 并在 PBMC-Tc 细胞转移约 2 个月后杀死实验小鼠的 PBMC-Tc 细胞不同，Allo HSC-iNKT 细胞不会引起 GVHD 并维持实验小鼠的长期存活。（图 5C 和 5D）。通过组织学分析证实，Allo HSC-iNKT 细胞移植实验小鼠中不发生GVHD，健康的组织结构没有淋巴细胞浸润；相反，对移植了 PBMC-Tc 细胞的实验小鼠的分析显示与大量淋巴细胞浸润相关的严重组织损伤（图5E 和 5F）。最终研究结果表明 CAR 工程化和肿瘤遭遇不会改变 Allo HSC-iNKT 细胞的安全性。
总的来说，这一研究揭示了与其他健康供体 PBMC 衍生的同种异体细胞产品相比，Allo HSC-iNKT 细胞具有稳定的 HLA-I/II低表型；同时，Allo HSC-iNKT 细胞也表达低水平的应激分子，如 NKG2D 配体，使它们也能抵抗宿主 NK 细胞介导的同种异体排斥。Allo HSC-iNKT 细胞的这些“低免疫原性”特征支持它们有望在“现货细胞疗法”中得以应用。
后记
研究人员们现在正在努力改进制造工艺，转向无饲养层系统，该系统消除了对支持细胞（例如胸腺类器官中使用的细胞）的需要，以协助血液干细胞产生 iNKT 细胞。这将极大的简化此类细胞产品的生产，加速临床和商业转化应用。
参考资料：
[1] Development of allogeneic HSC-engineered iNKT cells for off-the-shelf cancer immunotherapy
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